Giới thiệu kỹ thuật Realtime PCR
Kỹ thuật realtime PCR là một phương pháp được sử dụng để khuếch đại phân tử ADN in vitro. Tuy nhiên, Realtime PCR khác phản ứng PCR thông thường ở chỗ nó có khả năng phát hiện và định lượng trực tiếp sản phẩm PCR sau mỗi chu kỳ của phản ứng. Phương pháp này đòi hỏi một máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị đo cường độ phát huỳnh quang từ giếng mẫu và được trang bị chương trình phần mềm cho phép xử lý kết quả, xác định sự biến đổi cường độ huỳnh quang trong từng phản ứng khuếch đại.
Nguyên lý của kỹ thuật Realtime PCR
Phản ứng Realtime PCR được thực hiện trong một máy gia nhiệt có khả năng chiếu sáng mỗi một mẫu với một chùm ánh sáng có chiều dài bước sóng nhất định. Ngoài ra máy PCR này còn xác định được bước sóng ánh sáng phát ra từ phân tử phát huỳnh quang bị kích hoạt trong ống PCR. Từ đó máy có thể xác định được tín hiệu huỳnh quang thay đổi sau mỗi chu kỳ do số lượng phân tử ADN được tổng hợp tăng lên. Vì vậy có thể tính được lượng sản phẩm ADN thu được sau phản ứng.
Như vậy quy trình thực hiện kỹ thuật realtime PCR cũng theo nguyên tắc thông thường của phản ứng tổng hợp chuỗi. Tuy nhiên, đặc điểm khác biệt chính là đoạn DNA được nhân lên sẽ được phá hiện tại mỗi thời điểm diễn ra phản ứng (realtime). Real time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận hoặc nghịch với số đoạn DNA tạo thành.
Hoá chất và thuốc thử trong kỹ thuật realtime PCR
Chìa khoá kỹ thuật chính trong kỹ thuật realtime PCR chính là chất phát huỳnh quang. Nó sẽ phát huỳnh quang hoặc không phát quang khi có sự hiện diện của sản phẩm khếch đại từ DNA đích. Một số chất huỳnh quang thường được sử dụng:
Chất huỳnh quang: màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA có ái lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi DNA và ái lực này làm cho sợi đôi phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Do đó, máy sẽ xác định được cường độ ánh sáng huỳnh quang phát ra tăng lên sau mỗi chu kỳ phản ứng.
Đầu dò phát huỳnh quang (Probe): là những đoạn oligonucleotide sợi đơn có trình tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích. Đầu dò oligonucleotide này được gắn các phân tử có thể phát huỳnh quang. Sự phát quang này thông thường xuất hiện khi có mặt sự kết cặp của đầu dò (probe) với phân tử ADN đích. Vì vậy cường độ phát quang sẽ thay đổi sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR. Qua đó máy Realtime giúp định lượng được số bản sao được nhân lên tại mỗi thời điểm. Ngoài ra còn nhiều cơ chế phát quang được các nhà nghiên cứu phát triển nữa. Nhưng nhìn chung đều dựa vào sự thay đổi cường độ huỳnh quang sau mỗi chu kỳ phản ứng, do phân tử ADN đích được tạo ra nhiều hơn.
Ứng dụng
Có rất nhiều ứng dụng của kỹ thuật realtime PCR trong các phòng thí nghiệm. Kỹ thuật này được sử dụng phổ biến trong cả chẩn đoán và nghiên cứu cơ bản. Trong công nghiệp, kỹ thuật này được sử dụng để định lượng các vi sinh vật có trong thức ăn và rau, hoặc sử dụng để xác định các sinh vật biến đổi gen và định lượng xác định kiểu gen các virut gây bệnh ở người.
Ứng dụng trong chẩn đoán: Real time PCR được sử dụng trong việc phát hiện nhanh các axit nucleic có ý nghĩa chẩn đoán như xét nghiệm viêm gan C (HCV), viêm gan B (HBV), xét nghiệm HIV, ung thư, và có thể cả bất thường di truyền…
Ứng dụng trong lĩnh vực vi sinh vật học: kỹ thuật được sử dụng trong các lĩnh vực về an toàn thực phẩm, hư hỏng thực phẩm và lên men. Đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh như Salmonella, Listeria, E.coli O157,....
Ứng dụng trong nghiên cứu: trong nghiên cứu, Real time PCR được sử dụng với mục đích chính là định lượng số bản phiên mã của gen. Kỹ thuật được sử dụng trong phát hiện sự biến đổi trong biểu hiện của một gen qua thời gian.
Định lượng lâm sàng và kiểm tra hiểu gen: sự có mặt của real time PCR giúp cùng lúc định lượng và kiểm tra kiểu gen của một virut. Mức độ nhiễm được định lượng bằng số bản sao của hệ gen virut trên một đơn vị.
Nguồn SBC Scientific
Kỹ thuật realtime PCR là một phương pháp được sử dụng để khuếch đại phân tử ADN in vitro. Tuy nhiên, Realtime PCR khác phản ứng PCR thông thường ở chỗ nó có khả năng phát hiện và định lượng trực tiếp sản phẩm PCR sau mỗi chu kỳ của phản ứng. Phương pháp này đòi hỏi một máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị đo cường độ phát huỳnh quang từ giếng mẫu và được trang bị chương trình phần mềm cho phép xử lý kết quả, xác định sự biến đổi cường độ huỳnh quang trong từng phản ứng khuếch đại.
Nguyên lý của kỹ thuật Realtime PCR
Phản ứng Realtime PCR được thực hiện trong một máy gia nhiệt có khả năng chiếu sáng mỗi một mẫu với một chùm ánh sáng có chiều dài bước sóng nhất định. Ngoài ra máy PCR này còn xác định được bước sóng ánh sáng phát ra từ phân tử phát huỳnh quang bị kích hoạt trong ống PCR. Từ đó máy có thể xác định được tín hiệu huỳnh quang thay đổi sau mỗi chu kỳ do số lượng phân tử ADN được tổng hợp tăng lên. Vì vậy có thể tính được lượng sản phẩm ADN thu được sau phản ứng.
Như vậy quy trình thực hiện kỹ thuật realtime PCR cũng theo nguyên tắc thông thường của phản ứng tổng hợp chuỗi. Tuy nhiên, đặc điểm khác biệt chính là đoạn DNA được nhân lên sẽ được phá hiện tại mỗi thời điểm diễn ra phản ứng (realtime). Real time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận hoặc nghịch với số đoạn DNA tạo thành.
Hoá chất và thuốc thử trong kỹ thuật realtime PCR
Chìa khoá kỹ thuật chính trong kỹ thuật realtime PCR chính là chất phát huỳnh quang. Nó sẽ phát huỳnh quang hoặc không phát quang khi có sự hiện diện của sản phẩm khếch đại từ DNA đích. Một số chất huỳnh quang thường được sử dụng:
Chất huỳnh quang: màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA có ái lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi DNA và ái lực này làm cho sợi đôi phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Do đó, máy sẽ xác định được cường độ ánh sáng huỳnh quang phát ra tăng lên sau mỗi chu kỳ phản ứng.
Kỹ thuật Realtime PCR- Huỳnh Quang
Đầu dò phát huỳnh quang (Probe): là những đoạn oligonucleotide sợi đơn có trình tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích. Đầu dò oligonucleotide này được gắn các phân tử có thể phát huỳnh quang. Sự phát quang này thông thường xuất hiện khi có mặt sự kết cặp của đầu dò (probe) với phân tử ADN đích. Vì vậy cường độ phát quang sẽ thay đổi sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR. Qua đó máy Realtime giúp định lượng được số bản sao được nhân lên tại mỗi thời điểm. Ngoài ra còn nhiều cơ chế phát quang được các nhà nghiên cứu phát triển nữa. Nhưng nhìn chung đều dựa vào sự thay đổi cường độ huỳnh quang sau mỗi chu kỳ phản ứng, do phân tử ADN đích được tạo ra nhiều hơn.
Kỹ thuật realtime PCR- Đầu dò
Ứng dụng
Có rất nhiều ứng dụng của kỹ thuật realtime PCR trong các phòng thí nghiệm. Kỹ thuật này được sử dụng phổ biến trong cả chẩn đoán và nghiên cứu cơ bản. Trong công nghiệp, kỹ thuật này được sử dụng để định lượng các vi sinh vật có trong thức ăn và rau, hoặc sử dụng để xác định các sinh vật biến đổi gen và định lượng xác định kiểu gen các virut gây bệnh ở người.
Ứng dụng trong chẩn đoán: Real time PCR được sử dụng trong việc phát hiện nhanh các axit nucleic có ý nghĩa chẩn đoán như xét nghiệm viêm gan C (HCV), viêm gan B (HBV), xét nghiệm HIV, ung thư, và có thể cả bất thường di truyền…
Ứng dụng trong lĩnh vực vi sinh vật học: kỹ thuật được sử dụng trong các lĩnh vực về an toàn thực phẩm, hư hỏng thực phẩm và lên men. Đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh như Salmonella, Listeria, E.coli O157,....
Ứng dụng trong nghiên cứu: trong nghiên cứu, Real time PCR được sử dụng với mục đích chính là định lượng số bản phiên mã của gen. Kỹ thuật được sử dụng trong phát hiện sự biến đổi trong biểu hiện của một gen qua thời gian.
Định lượng lâm sàng và kiểm tra hiểu gen: sự có mặt của real time PCR giúp cùng lúc định lượng và kiểm tra kiểu gen của một virut. Mức độ nhiễm được định lượng bằng số bản sao của hệ gen virut trên một đơn vị.
Nguồn SBC Scientific
Nhận xét
Đăng nhận xét